Die Diagnose der Lyme-Borreliose beruht vor allem auf das Vorhandensein von Krankheitssymptomen im Zusammenhang mit einem möglichen Expositionsrisiko, wie etwa ein Spaziergang im Wald oder der Aufenthalt im Garten (auch ohne Erinnerung an einen Zeckenbiss). Ein Expositionsrisiko und die typischen Krankheitssymptome wie die Wanderröte sind ausreichend, um eine Diagnose zu stellen und die Behandlung zu beginnen.
Im Zweifelsfall oder bei schweren Anzeichen kann auch ein Labortest nötig sein. Meist besteht dieser Labortest aus einer serologischen Untersuchung (Suche nach Antikörpern). Bei einem positiven oder unsicheren Ergebnis wird ein Test zur Bestätigung (Western Blot) durchgeführt. Tests, bei denen direkt nach dem Krankheitserreger gesucht wird (Untersuchung mit dem Mikroskop, Kultur, Molekularbiologie), können in bestimmten Situationen durchgeführt werden, sind jedoch nur in wenigen spezialisierten Labors möglich und oft unzureichend empfindlich.